Die ursprüngliche Idee zu diesem Trauerspiel fasste Schiller schon 1783, als er sich auf der Flucht in Bauerbach – unmittelbar nach Vollendung von Kabale und Liebe – mit dem Stoff beschäftigte und wahrscheinlich schon das Schema für den ersten Akt entwarf. Aber andere Studien und Entwürfe, vor allem sein Don Carlos und der Wallenstein, drängten den neuen Plan auf lange Zeit in den Hintergrund.
Erst 16 Jahre später, als Schiller von Weimar nach Jena zurückkehrte, nahm er am 26. April 1799 die Geschichte der Maria Stuart vor. Er studierte ihren Prozess, die Regierungsgeschäfte der Königin Elisabeth und machte sich mit dem englischen Verfassungsleben und den damaligen reformatorischen Bestrebungen auf kirchlichem Gebiet genauer bekannt. Anfangs zweifelte er noch, ob er seine dichterische Tätigkeit der Maria Stuart oder den Maltesern, einem anderen poetischen Stoff, zuwenden sollte. Aber nach der langen Beschäftigung mit dem Wallenstein war er der Soldaten, Helden und Herrscher vorläufig satt und freute sich, dass die Geschichte ihm hier zwei Frauen bot, deren leidenschaftlich erregte Gemütsstimmung ein rein menschliches Interesse gewährte und deren tragischen Konflikt er individuell gestalten konnte. Obwohl er noch nicht über alle Punkte mit sich einig und das Schema für das ganze Stück noch nicht entworfen war, ist Schiller schon im Juni mit lebhaftestem Interesse am ersten Akt beschäftigt. Ende Juli 1799 hatte er ihn fertiggestellt. Im August folgte der zweite Akt, worauf eine längere Pause eintrat.
Die Entbindung seiner Frau und eine schwere Krankheit hielten Schiller von der weiteren Arbeit zurück. Hinzu kam die Herausgabe seines Musenalmanachs, so dass er sich auf einige Zeit lang in eine lyrische Stimmung versetzte. Aber im Winter rückte die Arbeit an der Maria Stuart wieder vorwärts. Zudem ging sein Wunsch in Erfüllung, nach Weimar überzusiedeln, den er Anfang Dezember 1799 erfüllt sah. Am letzten Abend des Jahres konnte er noch „einen seiner Helden“, den Mortimer, „unter die Erde bringen“. Das Stück war also bei der vierten Szene des vierten Aktes angelangt.
Die Vollendung des letzten Aktes verzögerte sich bis zum Mai 1800. In einer Abendvorlesung Schillers hören wir, dass der größte Teil der Maria Stuart fertig sei. Während er den fünften Akt bearbeitete, erfolgten bereits die Proben des Stückes für das Theater, so dass die erste Aufführung am 14. Juni 1800 stattfinden konnte.
Das Publikum war leider nicht ganz befriedigt, da die Darsteller nicht durchweg zu überzeugen vermochten. Als aber später in Lauchstädt, nachdem manches geändert und gekürzt worden war, eine Wiederholung stattfand, war das Verlangen nach dem Stück ein so Gewaltiges, dass dem Kassierer alle Eintrittskarten aus seiner Wohnung abgeholt wurden. Bei der Vorstellung musste die Musiker des Orchesters auf die Bühne gesetzt werden, um weiteren Raum für die Zuschauer zu gewinnen. Am 8. Januar 1801 wurde Maria Stuart zum ersten Mal in Berlin gegeben und ist seit jener Zeit ein viel gespieltes Stück geblieben.